I. JUDUL PERCOBAAN
“ Kromatografi Lapis Tipis ( Thing Layer Cromatografi, TLC ) “
II. TUJUAN PERCOBAAN
Memisahkan asam – asam amino dalam suatu campuran dengan cara kromatografi lapis tipis.
III. LANDASAN TEORI
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen – komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fase, salah satu fasa tersebut adalah soatu laisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan stasioner. Dalam tehnik kromatografi zat – zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, atau seperti dalam kromatografi kertasatau lapis tipis, ekivalen fisik kolom, dan tentu saja dasar pemisahan terletak pada laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda ( Khopkar, 2007 ).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas (KKt) adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana yang akan disajikan. Karena di sebagian besar laboratorium KKt telah diganti dengan KLT. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparative. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, Roy,J.1991:107-108).
Kromatografi lapis tipis ( KLT ) dikembangkan oleh Izmailof dan Schaiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroporesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fasa diamnya diisikan atau dikemas didalamya pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam ( uniform )pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat amilum atau dapat dikatakan sebagai bentukbentuk terbuka dari kromatogarfi kolom (Anonim, 2009 ).
Pada hakikatnya KLT melibatkan dua peubah, sifat fasa diam atau lapisan, dan sifat fasa gerak atau campuran pelarut pengembang, fasa diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai penyangga kromatografi cair – padat, atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair ( kromatografi cair – cair ), fasa diam pada KLT serinag disebut penyerap ( Day, 2002: 497 ).
Fasa diam KLT terbuat dari serbuk halus dengan ukuran 5-50 cm, serbuk halusini dapar berupa suatu adsorbs, suatu penukar ion, suatu pengayak molekul atau dapat merupakan penyangga yang dilapisi suatu cairan yang membuat lapisan tipis menjadi bubur ( slury ),yang berair dari serbuk tadi. Zat pengikat seperti gipz, barium sulfat, polivinil ( Soebagio, 2003 ; 87 ).
Pertimbangan untuk memilih pelarut pengembang ( eluen ) umumnya sama dengan pemilihan eluen untuk kromatografi adsorbs pengelusi eluen naik sejalan dengan polaritas missal ( heksana, aseton,alcohol dan air ).Eluen pengembang dapat dapat berupa pelarut tunggalatau campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelaryt – pelarut pengembang harus mempunyaikemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatografi yang tidak diharapkan ( Soebagio, 2003: 88 ).
Deteksi terhadap noda yang timbul pada KLT kadang – kadang lebih mudah dibandingkan kromatografi kertas karena dapat dipakai cara – cara yang lebih umum. Untuk senyawa organic dipakai cara enyemprot lempeng dengan asam sulfat kemudian dipanaskan sampai senyawa seperti orang dan timbul noda – nada hitam. Cara ini adalah cara kualitatif ( Tim dosen, 2010 : 13 ).
Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai RF yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai RF untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai RF dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa ( Underwood, 1986: 186 ).
IV. ALAT DAN BAHAN
A. ALAT
1. Pipa kapiler
2. Chamber
3. Penggaris
4. Pensil
5. Gunting
6. Oven
7. Penjepit kayu
B. BAHAN
1. Ninhidrin 0,3 % ( dalam butanol yang mengandung 3 % asam asetat )
2. Larutan pengelusi A ( butanol : asam asetat : air = 80 : 20 : 20 )
3. Larutan pengelusu B ( propanol : air = 70 : 30)
4. Larutan asam amino standar ( alaanin, asam aspartat,asam glutamate dan tirosin)
5. Campuran x yang akan diuji
6. Plat KLT
7. Aquadest
8. Tissue
V. PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan larutan asam – asam amino standar, kemudian menotolkanlarutan – larutan x pada 2 lempeng plat KLT yang berbeda
2. Menotolksan 1 tetes dari laritan asam amino dan senyawa x pada 2 lempemg yang berbeda
3. Membiarkan penotolan hingga kering, dan meletakkan masing – masing lempeng diatas larutan pengelusi A dan B ( 1 cm bagian bawah lempeng tercelup ) dan membiarkan pengellusi menyerap sampai pada tanda batas atas dari lempeng KLT
4. Mengeringkan dan menyemprotkan dengan larutan ninhidrin, dan membiarkan beberapa menit, jika tidak timbul warna ( noda ).
5. Menghitung harga RF dari asam amino dan campuran x yang dianalisis
VI. HASIL PENGAMATAN
| Komponen | Pengelusi A | Pengelusi B | |||||||
| Warna | Jarak noda | Jarak eluen | Rf | warna | Jarak noda | Jarak eluen | Rf | ||
| Standar | A B C D | Merah Merah Orange Ungu | 1,05 cm 1,10 cm 1,95 cm 0,90 cm | 5,70 cm 5,70 cm 5,70 cm 5,70 cm | 0,18 0,19 0,34 0,16 | Ungu tua Ungu muda Ungu Ungu | 4,05 cm 3,10 cm 3,35 cm 4,30 cm | 6,0 cm 6,0 cm 6,0 cm 6,0 cm | 0,67 0,52 0,56 0,72 |
| Campuran | X | Ungu | 0,90 cm | 5,70 cm | 0,16 | Ungu | 4,20 cm | 6,0 cm | 0,70 |
Keterangan :
A = Asam Glutamat
B = Tirosin
C = Asam Aspartat
D = Alanin
X = Sampel
VII. ANALISIS DATA
Pengelusi A
1. Asam Glutamat
Dik : Jarak Noda = 1,05 cm
Jarak Eluen = 5,70 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
1,05 cm
Rf = = 0,18 5,70 cm
2. Tirosin
Dik : Jarak Noda = 1,10 cm
Jarak Eluen = 5,70 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
1,10 cm
Rf = = 0,19 5,70 cm
3. Asam Aspartat
Dik : Jarak Noda = 1,95 cm
Jarak Eluen = 5,70 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
1,95 cm
Rf = = 0,34 5,70 cm
4. Alanin
Dik : Jarak Noda = 0,90 cm
Jarak Eluen = 5,70 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
0,90 cm
Rf = = 0,16 5,70 cm
5. Sampel X
Dik : Jarak Noda = 0,90 cm
Jarak Eluen = 5,70 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
0,90 cm
Rf = = 0,16 5,70 cm
Pengelusi B
1. Asam Glutamat
Dik : Jarak Noda = 4,05 cm
Jarak Eluen = 6,00 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
4,05 cm
Rf = = 0,67 6,00 cm
2. Tirosin
Dik : Jarak Noda = 3,10 cm
Jarak Eluen = 6,00 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
3,10 cm
Rf = = 0,52 6,00 cm
3. Asam Aspartat
Dik : Jarak Noda = 3,35 cm
Jarak Eluen = 6,00 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
3,35 cm
Rf = = 0,56 6,00 cm
4. Alanin
Dik : Jarak Noda = 4,30 cm
Jarak Eluen = 6,00 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
4,30 cm
Rf = = 0,72 6,00 cm
5. Sampel X
Dik : Jarak Noda = 4,20 cm
Jarak Eluen = 6,00 cm
Dit : Rf = ….?
Peny : Jarak yang ditempuh noda
Rf = Jarak Eluen
4,20 cm
Rf = = 0,70 6,00 cm
VIII. PEMBAHASAN
Pada percobaan ini dilakukan pemisahan asam amino dalam suatu campuran dengan cara kromatografi lapis tipis ( KLT ). Ada pun asam amino yang dijadikan sebagai standar adalah alanin, asam glutamat, asam aspatat dan tirosin sama halnya dengan kromatografi kertas. Pada percobaan ini didasarkan pada perbedaan kecepatan distribusi suatu komponen diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya berupa satu lapisan lapisan tipis yang memiliki absorban, sedangkan fase geraknya yaitu berupa pengelusi A dan pengelusi B. Tehnik pemisahan ini terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap penotolan , tahap pengembangan dan tahap identifikasi. Pada tahap penotolan alanin, asam glutamate, asam aspartat, tyrosin dan sampel x di totolkan pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler, ini digunakan agar spot tidak menyebar pada saat penotolan sehingga akan memudahkan dalam pengamatan.
Setelah ditotoli asam – asam amino standar dan sampel x, kemudian plat dikeringkan, ini bertujuan untuk menguapkan HCl yang terdapat pada larutan. Setelah kering, plat KLT dielusi dalam chamber sampai batas rambat. Spot harus dijaga agar tidak terendam dalam eluen, karena apabila spoot terendam maka spot tidak akan merembes tetapi akan bercampur dengan eluen. Ketika eluen mencapai batas rambat, kemudian plat dikeluarkan lalu dikeringkan.Selanjutnya plat disemprotkan dengan menggunakan ninhidrin agar noda – noda hasil pemisahan dapat diamati, karena sebelum penyomprotan dengan ninhidrin noda – noda warna belum Nampak, kemudian plat dipanaskan dalam oven hingga timbul warna. Pemanasan ini bertujuan untuk menghilangkan pengelusi yang masih terikat pada lapisan adsorban, akibat hilangnya pengelusi tersebut akan memudahkan terjadinya reaksi antara ninhidrin dengan asam – asam amino serta sampe x.
Adapun reaksi yang terjadi pada saat plat ditotoli oleh asam amino dan di semprot dengan ninhidrin adalah:
1. Asam glutamat
2. Tirosin
3. Asam aspartat
4. Alanin
Adapun penampakan warna pada setiap asam amino adan sampel x yaitu asam glutamate berwarna merah dan memiliki Rf = 0,18, tirosin berwarna merah dan Rf = 0,19, asam aspartat berwarna orange dengan Rf = 0,34, alanin berwarna ungu dengan Rf = 0,16 sedangan sampel x berwarna ungu denngan Rf = 0,16.Dari data tersebut dapat diidentifikasi bahwa sampel X merupakan asam amino dan sampel X yang menggunakan pengelusi B adalah asam glutamate berwarna ungu tua dengan Rf = 0,67, tirosin berwarna ungu muda dengan Rf = 0,52, asam aspartat berwarna ungu dengan Rf = 0,56. Daridata tersebut diketahui bahwa secara kualitatif berdasarkan noda bahwa sampel x merupakan asam glutamate, tetapi secara kualitatif tidak dapat diketahui karena memiliki harga Rf yang berbeda – beda.
IX. PENUTUP
A. KESIMPULAN
Setelah melakukan percobaan maka dapat disimpulkan bahwa ;
1. Harga Rf dari asam glutamate pada pengelusi A adalah 0,18 dan pada pengelusi B adalah 0,67
2. Harga Rf dari tirosin pada pengelusi A adalah 0,19 dan pada pengelusi B adalah 0,52
3. Harga Rf dari asam aspartat pada pengelusi a adalah 0,34 dan pada pengelusi B adalah 0,56
4. Harga Rf dari alanin pada pengelusi A adalah 0,16 dan pada pengelusi B adalah 0,70
5. Harga Rf dari sampel X pada pengelusi A adalah 0,16 sedangakan pada pengelusi B adalah 0,70
6. Sampel X yang merupakan asam amino glutamate.
B. SARAN
Untuk praktikan selanjutnya, sebaiknya dalam menotolkan asam amino harus harus ditetesi pada plat KLT yang lain atau plat yang tidak dignakan lagi hingga diperoleh penotolan yang sesuai atau penotolan yang lebih kecil.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar